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The aim of this work was to study the standardization of conditions to obtain and regenerate Epulorhiza repens and Ceratorhiza sp. protoplasts. For E. repens, the largest number of protoplasts (8.0 &#215; 10(6) protoplasts/mL) was obtained in 0.6 M KCl, using 15 mg/mL of Lysing Enzymes, and 2-day-old fungal mycelium. When 0.5 M sucrose was used as osmotic stabilizer, the highest frequency of regeneration was achieved (8.5 %); 80.0 % of protoplasts were nucleated, and 20.0 % anucleated. For Ceratorhiza sp., the largest number of protoplasts (4.0 &#215; 10(7) protoplasts/mL) was achieved in 0.6 M NaCl, when 15 mg/mL of Lysing Enzymes and 15mg/mL of Glucanex, with 2-day-old fungal mycelium were used. The highest frequency of regeneration was 6.7 % using 0.5 M sucrose as osmotic stabilizer; 88.8 % of protoplasts were nucleated, and 11.2 % anucleated.<br>O objetivo deste trabalho foi padronizar as condições de obtenção e regeneração de protoplastos de Epulorhiza repens e Ceratorhiza sp. Para o fungo E. repens, a maior produção de protoplastos, 8.0 x 10(6) protoplastos/mL, foi obtida em KCl 0.6 M, na presença de 15 mg/mL de "Lysing Enzymes" e micélio fúngico com 2 dias de idade. A maior freqüência de regeneração obtida foi de 8,5 % quando sacarose 0.5 M foi utilizada como estabilizador osmótico. Do total de protoplastos obtidos, 80 % eram nucleados e 20 % anucleados. Para Ceratorhiza sp., a maior produção de protoplastos, 4,0 x 10(7) protoplastos/mL, foi obtida em NaCl 0.6 M, na presença de 15 mg/mL de "Lysing Enzymes" e 15mg/mL de Glucanex, e micélio fúngico com 2 dias de idade. A maior freqüência de regeneração obtida foi de 6.7 % utilizando sacarose 0.5 M como estabilizador osmótico. Do total de protoplastos obtidos, 88.8 % eram nucleados e 1.2 % anucleados. O estabelecimento de protocolo otimizado para obtenção e regeneração de protoplastos dos fungos E. repens e Ceratorhiza sp. é importante, permitindo o estabelecimento de técnicas de transformação genética, o isolamento de mutantes, a determinação de cariótipo eletroforético e o cruzamento de linhagens.