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Neste trabalho foi descrito um protocolo simples, rápido e barato para detecção e diferenciação do herpesvírus bovino -1 (BoHV-1) e do herpesvírus bovino -5 (BoHV-5). Os DNAs foram extraídos de sobrenadantes de cultura de células infectadas pelo vírus e diretamente de amostras clínicas. Para a extração destes DNAs foi otimizado um protocolo em que se utiliza o NaOH e os DNAs extraídos foram amplificados utilizando-se a reação em cadeia pela polimerase. O fragmento obtido foi então submetido a digestão com enzima de restrição e posterior observação em gel de agarose. Através deste procedimento foi possível diferenciar BoHV-1 de BoHV-5. Estes resultados foram confirmados por sequenciamento. Esta metodologia poderá ser útil em laboratórios de diagnósticos de rotina para detectar e diferenciar estas amostras virais tanto de cultura de tecidos quanto de amostras clínicas.