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O isolamento e regeneração de protoplastos de fungos é um passo fundamental para o estabelecimento de sistemas de transformação, análise do cariótipo molecular e fusão entre linhagens, que são técnicas de ampla aplicação em programas de melhoramento para fungos filamentosos. Neste trabalho foram testados diferentes preparações enzimáticas e estabilizadores osmóticos para estabelecer condições otimizadas de isolamento e regeneração de protoplastos de Penicillium brevicompactum, que é um excelente produtor de pectinases. Protoplastos de P. brevicompactum foram obtidos em maior quantidade quando o micélio foi digerido com 15mg.mL-1 de Glucanex (Novo Nordisk) em NaCl 0,8 mol.L-1 como estabilizador osmótico. O melhor estabilizador osmótico para a regeneração dos protoplastos foi KCl 0.8 mol.L–1 apresentando uma freqüência de regeneração de 36,58%. Esse protocolo pode ser utilizado em análises genéticas para essa espécie de Penicillium cujos estudos têm sido pouco reportados