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O gênero Spatuloricaria (Loricariinae, Loricariidae) compreende 12 espécies com caracterização pouco precisa, com dados morfológicos insipientes e nenhuma informação cariotípica disponível. Neste trabalho foi feita a primeira caracterização citogenética de uma espécie de Spatuloricaria do rio Xingu, utilizando técnicas de coloração convencional, bandeamento C, CMA3, DAPI, hibridização in situ fluorescente (FISH) com sondas teloméricas e DNAr18S. Os resultados mostram que Spatuloricaria sp. apresenta 2n=66 (6st+7sm+4m+16a) e número fundamental (NF) 92. A heterocromatina constitutiva (HC) está presente nas regiões centroméricas e pericentroméricas dos cromossomos e no braço curto do par 15, coincidindo com as marcações de DAPI. A FISH com sondas de DNAr 18S marcou o par cromossômico oito em sua porção terminal correspondente à marcação de CMA3, sendo observado heteromorfismo de tamanho dessa região. Não foram observadas sequências teloméricas intersticiais. Estes dados poderão servir como marcadores citotaxonômicos para a melhor compreensão do grupo e suas relações dentro da família Loricariidae, permitindo traçar inferências sobre a evolução cromossômica do gênero e suas relações com outros loricarídeos. Palavras-chave: Loricariinae, citotaxonomia, FISH, sondas DNAr, sequências teloméricas. DOI: http://dx.doi.org/10.18561/2179-5746/biotaamazonia.v4n1p30-36