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Os nematoides da família Anisakidae Skrjabin e Karokhin, 1945 são parasitos de organismos aquáticos, como peixes, mamíferos marinhos e aves piscívoras sendo distribuídos em grande parte do mundo. Suas larvas são um grande problema para a indústria pesqueira, uma vez que estas são agentes causadores de anisaquíase humana, a qual ocorre através da ingestão de larvas presentes em frutos do mar crus ou mal cozidos. O objetivo deste estudo foi caracterizar as larvas de Anisakis spp. parasitando os hospedeiros Michole-quati Pinguipes brasilianus Cuvier, 1829, Dourado-cachorro Auxis thazard Lacépède, 1800 (peixes de importância comercial) e Galo de fundo Zenopsis conchifer Lowe, 1852, no litoral do Estado do Rio de Janeiro, Brasil, utilizando ferramentas morfológicos e moleculares. Foram analisados 30 peixes da espécie P. brasilianus (Pinguipedidae), 02 de A. thazard (Scombridae) e 10 de Z. conchifer (Zeidae), sendo coletadas um total de 04 larvas de Anisakis spp. Baseado nas análises moleculares utilizando sequencias de DNA mitocondrial e ribossomal, bem como nos dados morfológicos, foram identificadas as espécies Anisakis typica Diesing, 1860 e Anisakis brevispiculata Dollfus, 1966. Zenopsis conchifer representa um novo registro de hospedeiro para A. typica, e este é o primeiro registro da larva de A. brevispiculata em águas costeiras do Brasil.